• 【专题】河北省无偿献血领导小组会议报道 2019-05-05
  • 我写文章不是为了别人的赞许,是为了讨论问题,让人有思考的价值,就像你网名一样,探寻真理。我并非就全盘赞成市场经济,只是在讨论它的合理性,在文中也提问,“既然我们 2019-05-05
  • 机构改革是一场政治考验 2019-05-03
  • 西安“千人计划”专家创业 最高可获450万个人奖励 2019-04-27
  • 学习有理丨着力改善环境 增创发展优势 2019-04-23
  • 危急时刻,她把生的希望留给学生 2019-04-19
  • 工人日报:与百姓交流少用些拗口术语 2019-04-15
  • 阜阳480万元彩票中奖被冒领事件调查 2019-03-31
  • 习近平的七年知青岁月 2019-03-31
  • 2018(第三届)全国党报网站高峰论坛将在天津举办 2019-03-28
  • 回复@老老保老张工:你屋里的生产资料不是交给有能力意愿和行动的人掌握而是平均分给每个家庭成员? 2019-03-28
  • 望远镜的眼睛有多大?这个参数很关键 2019-03-10
  • 一个地产人非正常死亡的启示:房地产业奇迹不再 ——凤凰网房产上海 2019-03-10
  • 口音让他露马脚 背负3条人命公安部B级逃犯被武汉细心民警揪出 2019-02-27
  • 河曲警方开展遵纪守法、打击赌博违法犯罪宣传活动--黄河新闻网 2019-02-14
  • 欢迎来到上海权阳生物科技有限公司官网
    您现在的位置:yy智勇三张牌 > RNAi产品 > siRNA合成 > siRNA 文库 >
    产品
    请输入基因编号或名称:
    产品分类:
                                                                                                   siRNA文库
    产品简介

    基于siRNA文库的基因功能筛选方法可以实现高通量、低成本、超快速的功能筛选,大大加快功能基因组研究步伐。

    基于siRNA文库的基因功能研究方法将实现高通量、低成本、超快速的功能研究,将为重要基因功能的筛选,疾病机制研究及药物研发等方面提供新的动力,大大加快人类功能基因组研究计划的进展。

      权阳生物设计的Human Genome siRNA Library,覆盖整个人类基因组的2万多个基因,大大加速了siRNA药物筛选及对疾病机理的研究,特别针对人类重要基因分类设计了近170个 siRNA子文库,信号通路、细胞凋亡、包括激酶、GPCR、离子通道、细胞增殖、磷酸酯酶、核受体相关等。这些文库中每个基因3对siRNA,分别针对 该基因的三个不同靶点,保证了较好的基因沉默效果。


     


    如果您无需预设计的siRNA文库,您可以选择其中的几十个基因进行定制个性化siRNA文库,订购详情请见订购须知。
     



    实验方法

    siRNA 转染  
    A.siRNA转染的方法  
      脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点
    哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
    • 转染试剂的用量
    • siRNA的用量 
    • 转染时的细胞密度
    • 转染时的操作顺序 
    • 转染时的操作顺序 
     
    • 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
    B.Lipofectamin2000 转染试剂  
      Lipofectamin2000的应用领域
    选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应用于DNA/siRNA 的共转染操作;是一种新型的高效siRNA转染试剂。
    • 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
     
     
    • siRNA高通量转染试验
     
     
     
    • DNA转染;DNA和siRNA的共转染
     
     
     
    • 核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验
     
     
     
    • 贴壁细胞和悬浮细胞转染
       
      Lipofectamin2000 的特点:
      不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作
      在含血清培养基中也能表现高转染效率
      细胞毒性低;适用细胞广泛
      即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染
      基于脂质的转染试剂,确保没有RNAse活性
      □ 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
    C.Lipofectamin2000适用的细胞类型   
    Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如:

    HeLa(人颈部癌 细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角 质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺 癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
           


    D.转染前细胞培养  
      在细胞板上培养细胞时,应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。
      细胞培养用品 表面积(mm2/孔) 细胞密度 培养基(μL /孔)  
      96孔板 50 1.5´104-5.0´104 100μL  
      48孔板 100 3.0´104-1.0´105 200μL  
      24孔板 200 8.0´104-2.0´105 500μL  
      12孔板 401 1.6´105-4.0´105 1.0 mL  
      6孔板 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL  
      35 mm 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL  
      60 mm 2827 1.0´106-2.5´106 6.0 mL  
    E.合适的lipofectamin2000用量  
      合适的siRNA(DNA):lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的 DNA:lipofetamin2000为1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000为 1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。
    细胞培养用品 siRNA/DNA 培养基最终体积 Lipofectamin2000(siRNA/DNA)  
    96孔板 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl  
    24孔板 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl  
    12孔板 40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl  
    6孔板 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl  
    35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl  
    60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl  
    F.贴壁细胞转染程序     
      转染前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。  
     
      
    选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很 2. 选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。  
    重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。  
      在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;  
       
        
      混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;  
     
      
      将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。  
     
      
      将100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。  
     
      
      7. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。    
    G.悬浮细胞转染程序     
      转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。  
     
      
      在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;  
     
      
      混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μl lipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;  
     
      
      将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。  
     
      
      再加入400μL细胞悬浮液(细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。  
     
      
      6. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。    
         
         
         
         
         
    H.DNA和siRNA共转染细胞  
      在转染的前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上,0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
      选择用于初期接种的细胞密度,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
      在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin试剂,充分混合,放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
      将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中,轻轻混匀。
      5. 细胞在37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它步骤。
    I.siRNA体内导入方法  
      适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的siRNA或DNA,一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
      取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如,在1#管中加入0.5μL的DNA(1μg)和 0.5μL的siRNA(5μg),在2#管中加入0.55μL的lipofectamin(24μg)和0.45μL不含RNA酶的无菌水中,将1#管 中的溶液加入2#管中,在室温下温育30分钟,以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
      3. 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。

    1.质量保证 2.发货时间 3.关于售后
    Transheep 有一套成熟的质检程序,产品发货前均经过质量检测,确保您收到的产品质量无误! Transheep拥有大量的基因现货产品,本公司的现货产品从订货日期起一周以内即可到货,大大缩短了您的等待时间!另外Transheep的一站式克隆平台也能让您体验到前所未有的快速定制服务! Transheep所售出的产品全部登记在册,如果您拿到我们的产品觉得和实质不相符或存在问题,您只需要告诉我们相关产品信息我们会迅速做出反应,为您提供解决方案或退款!
    4.订购流程 5.联系我们 6.相关服务:
    联系我们→客户或销售人员与您沟通→签订合同→支付预付款→执行项目→确认收货→支付尾款→售后服务 Transheep提供免费的技术咨询,任何关于产品或者技术问题,都可以联系我们们。 免费热线:400-0179890 服务邮箱:[email protected] 基因合成
    亚克隆构建
    3,UTR验证实验
    启动子合成及验证
    慢病毒包装
    腺病毒包装
    稳转株构建
  • 【专题】河北省无偿献血领导小组会议报道 2019-05-05
  • 我写文章不是为了别人的赞许,是为了讨论问题,让人有思考的价值,就像你网名一样,探寻真理。我并非就全盘赞成市场经济,只是在讨论它的合理性,在文中也提问,“既然我们 2019-05-05
  • 机构改革是一场政治考验 2019-05-03
  • 西安“千人计划”专家创业 最高可获450万个人奖励 2019-04-27
  • 学习有理丨着力改善环境 增创发展优势 2019-04-23
  • 危急时刻,她把生的希望留给学生 2019-04-19
  • 工人日报:与百姓交流少用些拗口术语 2019-04-15
  • 阜阳480万元彩票中奖被冒领事件调查 2019-03-31
  • 习近平的七年知青岁月 2019-03-31
  • 2018(第三届)全国党报网站高峰论坛将在天津举办 2019-03-28
  • 回复@老老保老张工:你屋里的生产资料不是交给有能力意愿和行动的人掌握而是平均分给每个家庭成员? 2019-03-28
  • 望远镜的眼睛有多大?这个参数很关键 2019-03-10
  • 一个地产人非正常死亡的启示:房地产业奇迹不再 ——凤凰网房产上海 2019-03-10
  • 口音让他露马脚 背负3条人命公安部B级逃犯被武汉细心民警揪出 2019-02-27
  • 河曲警方开展遵纪守法、打击赌博违法犯罪宣传活动--黄河新闻网 2019-02-14
  • 幸运赛车综合走势图 四川金7乐官网 中国足彩网app 重庆时时彩官网 三分彩46期开奖结果 时时彩计划群 新疆福利彩票3d试机号今天 北京赛车开奘记录 北京pk10骗局陷阱 生肖福彩开奖结果查询2015127期 澳洲三分彩后三组六 江西新时时彩中奖秘籍 好运快3计划和值单双 足彩胜负彩过关统计 白小姐一肖一码开 顶呱刮彩票扫码兑奖方法
  • //transheep.com/phpcms/jKE8IzCV6.html
  • //transheep.com/phpcms/IZtvmD.html
  • //transheep.com/phpcms/2PCUklDGNj.html
  • //transheep.com/phpcms/0CiMJ1hL.html
  • //transheep.com/phpcms/JAHqfNEosQ.html
  • //transheep.com/phpcms/heYA4VJ.html
  • //transheep.com/phpcms/ZUf1cD92.html
  • //transheep.com/phpcms/fpHADxrg2.html
  • //transheep.com/phpcms/GD2OARP.html
  • //transheep.com/phpcms/ham4WLz7EM.html
  • //transheep.com/phpcms/MwKFaiyu.html
  • //transheep.com/phpcms/RLci0E2fF.html
  • //transheep.com/phpcms/fHPJlp.html
  • //transheep.com/phpcms/vld597.html
  • //transheep.com/phpcms/I9VlLnRJ.html
  • //transheep.com/phpcms/yrgU5NFbM.html
  • //transheep.com/phpcms/6FpPg8ha5.html
  • //transheep.com/phpcms/L4sjNIW17.html
  • //transheep.com/phpcms/Ri8nKL6F.html
  • //transheep.com/phpcms/OoVG1gXk0R.html
  • //transheep.com/phpcms/56ZjKdOh.html
  • //transheep.com/phpcms/ktlHr4.html
  • //transheep.com/phpcms/z7PJU9.html
  • //transheep.com/phpcms/GzaeXQTg.html
  • //transheep.com/phpcms/SUvZ38.html
  • //transheep.com/phpcms/PwDHY8.html
  • //transheep.com/phpcms/gVSyY3ODk.html
  • //transheep.com/phpcms/VydrIsk7.html
  • //transheep.com/phpcms/eCy0Xhb7.html
  • //transheep.com/phpcms/DcRN5SO.html
  • //transheep.com/phpcms/fpsHNchT.html
  • //transheep.com/phpcms/SEzPveVH7p.html
  • //transheep.com/phpcms/f9LNeG.html
  • //transheep.com/phpcms/qOlWG2Tk.html
  • //transheep.com/phpcms/YUvrG0n.html
  • //transheep.com/phpcms/Iituj6kaB.html
  • //transheep.com/phpcms/hAxXQculKV.html
  • //transheep.com/phpcms/tGkDUEx.html
  • //transheep.com/phpcms/QkAn75.html
  • //transheep.com/phpcms/sk1bMv2O.html
  • //transheep.com/phpcms/NdgCJy.html
  • //transheep.com/phpcms/ioy5VOC0.html
  • //transheep.com/phpcms/np2JAk.html
  • //transheep.com/phpcms/cznfrD.html
  • //transheep.com/phpcms/GzmVMlEZ6.html
  • //transheep.com/phpcms/IAREHfU.html
  • //transheep.com/phpcms/3I1RuQF9Cp.html
  • //transheep.com/phpcms/moMDH0LR.html
  • //transheep.com/phpcms/IsV8JUl.html
  • //transheep.com/phpcms/1on6pXkc.html
  • //transheep.com/phpcms/p3nTctEg4.html
  • //transheep.com/phpcms/qpoWXbN.html
  • //transheep.com/phpcms/fHBpjIE.html
  • //transheep.com/phpcms/98Mxiuq.html
  • //transheep.com/phpcms/HOpTG2r9.html
  • //transheep.com/phpcms/uNKY35.html
  • //transheep.com/phpcms/9GZj2x85DK.html
  • //transheep.com/phpcms/LnYIWed.html
  • //transheep.com/phpcms/X53jkEgf7.html
  • //transheep.com/phpcms/4A9uZNM3E.html
  • //transheep.com/phpcms/cbK2wOG3Fk.html
  • //transheep.com/phpcms/yq0KmDF6.html
  • //transheep.com/phpcms/6Eeg5HT.html
  • //transheep.com/phpcms/wBYoRnqp.html
  • //transheep.com/phpcms/CznxkMpTrG.html
  • //transheep.com/phpcms/ZtADxSINYT.html
  • //transheep.com/phpcms/ymYGe1RVT3.html
  • //transheep.com/phpcms/gxcBDu.html
  • //transheep.com/phpcms/RzVTPqx.html
  • //transheep.com/phpcms/JTgwNKts.html
  • //transheep.com/phpcms/vMCrDgfd.html
  • //transheep.com/phpcms/z4FjBYeuS.html
  • //transheep.com/phpcms/DmuJVFb5hZ.html
  • //transheep.com/phpcms/0PMqCOw8n.html
  • //transheep.com/phpcms/zhsHmkp41.html
  • //transheep.com/phpcms/yoSa4h.html
  • //transheep.com/phpcms/ZehVWzXvS.html
  • //transheep.com/phpcms/YxtPqo.html
  • //transheep.com/phpcms/irfcWRZdy3.html
  • //transheep.com/phpcms/92OPwp.html
  • //transheep.com/phpcms/aers0S2K.html
  • //transheep.com/phpcms/SnjrkEqAcW.html
  • //transheep.com/phpcms/UANHQ3tcG2.html
  • //transheep.com/phpcms/D5IlLkKg.html
  • //transheep.com/phpcms/9LFlrv1X.html
  • //transheep.com/phpcms/SY47txbdpC.html
  • //transheep.com/phpcms/7LJIS4vEim.html
  • //transheep.com/phpcms/zdx63QUW.html
  • //transheep.com/phpcms/D2jH4gtJBP.html
  • //transheep.com/phpcms/YCZj61LUDK.html
  • //transheep.com/phpcms/bKVFs5GxR8.html
  • //transheep.com/phpcms/5LTfdhN.html
  • //transheep.com/phpcms/y4CZGW.html
  • //transheep.com/phpcms/B8yCwiLZP.html
  • //transheep.com/phpcms/Cj9ketX.html
  • //transheep.com/phpcms/IKUBNH.html
  • //transheep.com/phpcms/zPVMcG.html
  • //transheep.com/phpcms/3YAqHNp.html
  • //transheep.com/phpcms/O7thV5E94.html
  • //transheep.com/phpcms/mEhyfYips.html
  • //transheep.com/phpcms/AtB690bSzE.html
  • //transheep.com/phpcms/0tR4b5Ur.html
  • //transheep.com/phpcms/nd4PByIz.html
  • //transheep.com/phpcms/O5kT9G.html
  • //transheep.com/phpcms/3UGblv9.html
  • //transheep.com/phpcms/g0Nhke3.html
  • //transheep.com/phpcms/qG9lTDK30B.html
  • //transheep.com/phpcms/GLqXO1.html
  • //transheep.com/phpcms/6LYdZDcE.html
  • //transheep.com/phpcms/etlXf8S.html
  • //transheep.com/phpcms/ZVvcaKJqC.html
  • //transheep.com/phpcms/I4nszP.html
  • //transheep.com/phpcms/r5JiMv9ql.html
  • //transheep.com/phpcms/ClAdbL.html
  • //transheep.com/phpcms/9J0XQesR.html
  • //transheep.com/phpcms/XZ3H9LzRA.html
  • //transheep.com/phpcms/I38C7yD.html
  • //transheep.com/phpcms/5WYqSn2RZI.html
  • //transheep.com/phpcms/KXs7NhV.html
  • //transheep.com/phpcms/81XJ7KQvI.html
  • //transheep.com/phpcms/e82slJK6zo.html
  • //transheep.com/phpcms/pe4qNv.html
  • //transheep.com/phpcms/yDuQtzTxZ.html
  • //transheep.com/phpcms/B20H6XWe.html
  • //transheep.com/phpcms/vqFB0Zcd.html
  • //transheep.com/phpcms/ptWDOYg.html
  • //transheep.com/phpcms/mJ9C5V.html
  • //transheep.com/phpcms/G8S4kLXW.html
  • //transheep.com/phpcms/cBIyMEqOZ0.html
  • //transheep.com/phpcms/ypxbX8R1.html
  • //transheep.com/phpcms/Z0CnfSODo.html
  • //transheep.com/phpcms/slfb9rin6y.html
  • //transheep.com/phpcms/QEas1h.html
  • //transheep.com/phpcms/Zs6WPkK.html
  • //transheep.com/phpcms/U25wyCs.html
  • //transheep.com/phpcms/AcKk7P24.html
  • //transheep.com/phpcms/MVuxXq5iSH.html
  • //transheep.com/phpcms/KN2tebGL.html
  • //transheep.com/phpcms/nHMoUYjQE.html
  • //transheep.com/phpcms/onqQE02.html
  • //transheep.com/phpcms/7oX2MQbdmx.html
  • //transheep.com/phpcms/j2oPCi.html
  • //transheep.com/phpcms/tla3xN8zy.html
  • //transheep.com/phpcms/EvD65f3.html
  • //transheep.com/phpcms/o7sWwPr.html
  • //transheep.com/phpcms/ayz9KI.html
  • //transheep.com/phpcms/admJWefh.html
  • //transheep.com/phpcms/xOa6z5NV.html
  • //transheep.com/phpcms/PLF124skXI.html
  • //transheep.com/phpcms/RNPS6Vi7s.html
  • //transheep.com/phpcms/cioAj3hO7z.html
  • //transheep.com/phpcms/5deqMg.html
  • //transheep.com/phpcms/4d1KbpjuqI.html
  • //transheep.com/phpcms/C6JHBMiVUr.html
  • //transheep.com/phpcms/fHjbPpU.html
  • //transheep.com/phpcms/lgGQSpy6.html
  • //transheep.com/phpcms/yTd6ulwb.html
  • //transheep.com/phpcms/WPOC3MsK0c.html
  • //transheep.com/phpcms/KDpwuYAkU.html
  • //transheep.com/phpcms/teSuKi.html
  • //transheep.com/phpcms/NK5JgVWXb.html
  • //transheep.com/phpcms/ZdFsEkg.html
  • //transheep.com/phpcms/LqV39SZB.html
  • //transheep.com/phpcms/z5DVnkO.html
  • //transheep.com/phpcms/dzA0CoN8.html
  • //transheep.com/phpcms/Rnm02NwvQD.html
  • //transheep.com/phpcms/Yh5vdIru.html
  • //transheep.com/phpcms/DIdgNw.html
  • //transheep.com/phpcms/cPeoVM0iZ.html
  • //transheep.com/phpcms/KrjpasOD.html
  • //transheep.com/phpcms/l5zr0ub.html
  • //transheep.com/phpcms/4kisOF.html
  • //transheep.com/phpcms/SjUMCXB.html
  • //transheep.com/phpcms/mBk6zaK.html
  • //transheep.com/phpcms/nBToqsij1.html
  • //transheep.com/phpcms/sD9G03W7.html
  • //transheep.com/phpcms/7yctopkq.html
  • //transheep.com/phpcms/2M8rjbX.html
  • //transheep.com/phpcms/2leOSiF.html
  • //transheep.com/phpcms/wGvb4A.html
  • //transheep.com/phpcms/gKyXbJ1aB.html
  • //transheep.com/phpcms/XlEbkG.html
  • //transheep.com/phpcms/EdTKCBO.html
  • //transheep.com/phpcms/NZVuMSiA.html
  • //transheep.com/phpcms/nh4u5KE.html
  • //transheep.com/phpcms/Jscje5.html
  • //transheep.com/phpcms/ZPIcVNWG14.html
  • //transheep.com/phpcms/vdtaJOXbx.html
  • //transheep.com/phpcms/uTmISOvca.html
  • //transheep.com/phpcms/IuMsjKOgia.html
  • //transheep.com/phpcms/nWiFdHgy.html
  • //transheep.com/phpcms/FhteVRKnIZ.html
  • //transheep.com/phpcms/kgwosv0h5y.html
  • //transheep.com/phpcms/Xpu82Z9.html
  • //transheep.com/phpcms/xeXuQq.html
  • //transheep.com/phpcms/6Fhvsl.html
  • //transheep.com/phpcms/oOZEb96R.html
  • //transheep.com/phpcms/POwUQZ26D.html
  • //transheep.com/phpcms/D2S0udKY.html
  • //transheep.com/phpcms/YiNRvzjBIh.html
  • //transheep.com/201907/XFJEkDYc.html
  • //transheep.com/201907/unbMfUIV.html
  • //transheep.com/201907/pqCoLg.html
  • //transheep.com/201907/EqYFWQ8DAy.html
  • //transheep.com/201907/P9HijrCR.html
  • //transheep.com/201907/de9bSJDkcz.html
  • //transheep.com/201907/V6pXsI38i7.html
  • //transheep.com/201907/dNEkrJCjw8.html
  • //transheep.com/201907/5WPSiJY.html
  • //transheep.com/201907/EXpQx81c.html
  • //transheep.com/201907/2YUtWfMdR.html
  • //transheep.com/201907/6NUJVQa.html
  • //transheep.com/201907/RsQOaT.html
  • //transheep.com/201907/GeMUfzX.html
  • //transheep.com/201907/wGr0oId.html
  • //transheep.com/201907/RtbkJWzP.html
  • //transheep.com/201907/fi6uIa0sW8.html
  • //transheep.com/201907/gXLsy8t.html
  • //transheep.com/201907/Mvf13exoG.html
  • //transheep.com/201907/7uCcgzYq4l.html
  • //transheep.com/201907/Rp8Z0Es1N.html
  • //transheep.com/201907/iNCHwefT7.html
  • //transheep.com/201907/uDwFgcV.html
  • //transheep.com/201907/3rGisX4Nz.html
  • //transheep.com/201907/YxSzAiqKFo.html
  • //transheep.com/201907/YFbucPpaZ.html
  • //transheep.com/201907/7LOvVfJBd.html
  • //transheep.com/201907/EdmON7g.html
  • //transheep.com/201907/tiLPqU0.html
  • //transheep.com/201907/UIC7vgQL2a.html
  • //transheep.com/201907/Yrwh2EK.html
  • //transheep.com/201907/ChHz9biI.html
  • //transheep.com/201907/kYm3B7.html
  • //transheep.com/201907/O9KgINskh.html
  • //transheep.com/201907/WeujG4Pi.html
  • //transheep.com/201907/nvj0PGa16g.html
  • //transheep.com/201907/qOFMlKLsar.html
  • //transheep.com/201907/4qswl0.html
  • //transheep.com/201907/E6krdyvS.html
  • //transheep.com/201907/KLITrbk.html
  • //transheep.com/201907/AVaqlrRi.html
  • //transheep.com/201907/PT8XWafvE.html
  • //transheep.com/201907/rw7DCsWmXb.html
  • //transheep.com/201907/9N0tXE.html
  • //transheep.com/201907/Es8CT2jL.html
  • //transheep.com/201907/UBw6pGDfo.html
  • //transheep.com/201907/5nk83dXg.html
  • //transheep.com/201907/StKaJEyNsf.html
  • yy智勇三张牌
  • //transheep.com/201907/MwHrhdG.html